光學顯微鏡是在亞微米解析度開展生物醫學研究的重要工具。生物組織的精細結構複雜多樣，如何在三維空間用光學方法對其進行全面準確觀測是公認的難題。形態複雜的神經元是大腦基本的功能單元，如何獲取其完整結構對現有技術提出了極大的挑戰。熒游標記的神經元胞體直徑約為10-20微米，從胞體伸展出去的軸突和眾多的分支纖維直徑只有0.2-0.5微米，且多會投射到全腦的不同腦區。胞體與纖維在亮度上相差2-3個數量級，空間分佈常常又是交織在一起。當有周邊胞體的干擾下若要探測軸突上的微弱熒光訊號，就如同在明亮的太陽周邊觀察小星星。對此類情況，傳統的光學層析方法難以實現。

2021年3月1日，華中科技大學武漢光電國家研究中心生物醫學光子學功能實驗室駱清銘院士團隊在Nature Methods以長文形式發表了文章High-definition imaging using line-illumination modulation microscopy，開發了線照明調製顯微術並實現了高畫質成像。

駱清銘團隊提出了一種高畫質晰度、高通量的光學層析顯微成像新方法——線照明調製光學層析成像（Line illumination microscopy, LiMo）。他們巧妙地將線照明光強的高斯分佈作為一種天然的照明強度調製模式，不同照明強度只對焦面上的訊號產生相應調製，而對焦外背景訊號不調製。因此，採用多線探測的方式可以一次性記錄這些被不同強度調製的訊號，並且只需要最簡潔的一步線性計算，即可去除相同的焦外背景訊號，獲得清晰的焦面光學層析影象。與在生物醫學中廣泛使用的鐳射點共聚焦掃描顯微成像、雙光子激發熒光顯微成像、鐳射線共聚焦掃描顯微成像和結構光光學層析成像等經典方法相比，經理論推導證明LiMo的背景訊號具有更快的衰減係數。透過實驗測試也證明了這一結論，LiMo方法的信背比相比上述傳統方法提高了1-2個數量級。該方法只需要簡單的多線探測線照明光路，克服了傳統結構光照明成像中存在殘留調製偽影的固有缺陷，也無需多次成像即可獲得所需資料，並具有線掃描對大範圍樣本成像通量高的優點，解決了傳統熒光顯微光學層析成像方法無法同時兼顧高解析度、高通量和高畫質晰度的問題。可以說該方法不論是光路還是演算法，都充分體現了技術的簡潔之美。

圖1 LiMo顯微成像原理示意圖和效能測試結果

駱清銘團隊基於此進一步發展了高畫質熒光顯微光學切片斷層成像技術（High-definition fluorescent micro-optical sectioning tomography, HD-fMOST），將全腦光學成像從高解析度提升到高畫質晰度的新標準。近年來全腦光學成像為生物醫學研究帶來前所未有的豐富細節的同時，也產生資料量巨大的困難。為解決這個難題，研究者們主要集中在演算法領域尋求破解方案。駱清銘團隊獨闢蹊徑地指出解決大資料困惱的根本策略應是從源頭出發提升資料質量，進而提高後續資料處理和分析的效率。他們利用HD-fMOST對稀疏標記了神經元的小鼠全腦進行三維高畫質雙色成像，以0.3×0.3×1微米體素解析度在5天內獲取了12000張冠狀面影象及其細胞構築資訊，是目前以相近體素解析度實現全腦光學成像速度最快的技術。透過分析發現，原始資料有效訊號覆蓋16位動態範圍，平均信噪比高達110，可直接疊加生成全腦投影圖。高畫質晰度的資料質量使神經元形態的重建速度即使在複雜度增加5倍的情況下仍然提高近2倍。文章中還給出了線上定量統計特定型別神經元的全腦分佈結果，平均準確率達到95%，表明HD-fMOST獲得的高質量原始資料可支援線上分析。此外，該技術實現了小鼠全腦10 TB級原始資料集的線上無失真壓縮，壓縮率達到3%，可直接寫入隨身碟或上傳雲端，有望極大地減少高解析度全腦三維資料集在資料儲存和傳輸方面造成的負擔。

圖2 HD-fMOST對稀疏標記特定神經元的小鼠全腦進行高畫質三維成像的結果

綜上，該團隊提出的LiMo顯微術在快速高解析度光學成像時能顯著提高背景抑制能力。在此基礎上發展的HD-fMOST技術不僅極大地提高了全腦光學成像的資料質量，而且對該領域面臨的大資料難題開闢了全新的解決途徑，在資料儲存、傳輸、處理和分析等方面效率顯著提高了效率，有望在標準化、規模化的腦科學研究中發揮巨大作用。

鍾秋園博士與李安安教授為並列第一作者，駱清銘院士與袁菁教授為並列通訊作者，金銳博士生、張德潔碩士、李向寧教授、賈雪豔碩士、丁章恆博士生、羅盤博士、周燦博士生、姜辰宇碩士、豐釗博士、張智紅教授、龔輝教授為共同作者。

特別值得關注，Nature Methods期刊在同期還報道了對駱清銘教授的人物專訪。在採訪中，駱老師回顧了二十年的MOST研究歷程，指出HD-fMOST不是突發奇想一蹴而就的。面對全腦介觀神經聯接圖譜繪製的重大需求，整個團隊長期探索研發的工作，是在不斷的實驗中發現新問題，進而再解決之，推動技術持續創新的成果，將來還會不斷地有新方法新技術產出。